化學生物學實驗的教學實踐及其安全管理的論文
1 化學生物學實驗
作為一門強調實驗技術的學科, 化學生物學實驗課程內容涵蓋了合成化學、生物化學、分子生物學、生物醫藥等前沿研究在學科各方向的代表性工作, 諸如生物大分子的固相合成及質譜分析, 天然及非天然蛋白質的表達與活性表征, DNA及蛋白質的點擊化學反應, 小分子與蛋白及蛋白質組之間的相互作用等[5]。每個實驗內容都包括背景知識、實驗設計、實驗操作、分析討論及總結與思考五部分。舉例來說, 在“生物大分子的固相合成與質譜分析”實驗中, 學生會首先簡要了解生物大分子如核酸、多肽、蛋白質、脂類以及多聚糖的合成方法, 之后再以多肽的固相合成為例, 具體了解合成的原理、表征方式以及作為鑒定方式之一的質譜分析技術。實驗內容上, 選取具有生理意義的胸腺五肽 (TP-5) 為代表進行手工固相合成[8]。TP-5是基本序列為H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的氨基酸片段。它具有免疫調節作用, 對惡性腫瘤及自身免疫性疾病等有著較好的療效。TP-5合成后的處理及質譜鑒定完成后, 會引導學生對在實驗中遇到的問題, 如氨基酸偶聯對產率的影響等予以討論。實驗中, 使用哌啶和主要成分為三氟乙酸的切割試劑時, 需要在通風櫥內進行操作并佩戴護目鏡、口罩, 做好防護。三氟乙酸與N, N-二甲基甲酰胺 (DMF) 放熱也可能會導致多肽變質, 因此DMF需要在處理過程中完全除去。沉淀多肽所需的冷卻乙醚, 要在冰水浴中而非冰箱中冷卻, 防止由于冰箱啟動時閃爍起火而造成危險。多肽固相合成的其他方法以及固相合成技術在其他生物大分子中的應用也會留給學生做進一步的思考。通過完成這個實驗, 學生能夠理解多肽固相合成的原理、多肽/蛋白質藥物及生物大分子的檢測與鑒定技術, 為進一步了解蛋白質的半合成技術打下鋪墊。
“蛋白質連接反應與蛋白質半合成技術”實驗講述了表達蛋白連接技術、內含肽 (Intein) 蛋白的自剪切原理及蛋白質翻譯后修飾的重要生理意義。有了前面蛋白質全合成實驗的鋪墊, 蛋白質半合成的實驗教學進展較為順利。學習過生物化學課程的學生對蛋白質翻譯后的修飾并不陌生, 體內各種各樣的信號通路研究與修飾蛋白都密切相關。然而翻譯后修飾的蛋白由于穩定性等方面的原因并非都可以從蛋白生物表達中直接獲取, 而化學全合成則在合成分子量大的蛋白時存在困難, 因此, 蛋白質半合成就利用生物表達的方法得到自然化學連接中分子量較大的構建單元, 然后將化學合成的'多肽與重組表達的蛋白質片段進行連接, 從而得到目標蛋白質。學生在實驗中運用基于內含肽的蛋白質半合成技術完成泛素蛋白 (Ubiquitin) 的熒光標記, 并運用泛素水解酶及酶標儀來對產物的活性進行鑒定。實驗操作中, 根據實驗目的不同會使用到三種不同p H的PBS緩沖液。學生需要理解每一步當中使用不同p H的目的。在熒光標記泛素蛋白的步驟中, 我們發現問題最多的是將p H從3調節到6.8的實驗細節。這個步驟需要一直在冰鹽浴上操作以防止蛋白質的降解。前期實驗結果表明, p H高于7會導致泛素酰肼蛋白水解而最終無法完成蛋白質的半合成。在實驗進行中, 我們注意到在調節p H步驟上耗費較長時間、且沒有注意控制溫度的學生未能得到目的蛋白。但是, 積極地探索、思考問題的來源并尋求解決辦法, 教會學生面對不理想的實驗結果時如何進行分析并總結, 也正是課程教師想要傳遞給學生的, 因為這也是科學研究能夠不斷進步的動力。
“非天然氨基酸的定點嵌入與標記”實驗包含了非天然氨基酸定點引入的原理及應用, 生物正交反應、點擊化學的機理等。非天然氨基酸 (UAA) 上帶有不同熒光、特定反應活性或光操縱性質的基團, 當通過遺傳重組技術把它們引入到特定蛋白質 (如抗酸伴侶蛋白Hde A) 的特定位點后, 蛋白質就被賦予了新的性質, 從而可以研究它們與其他蛋白或蛋白質組的互作。本實驗課程設計是在抗酸伴侶蛋白Hde A中定點引入帶有炔烴的非天然氨基酸, 然后通過Click化學將它與帶有疊氮基團的熒光分子Alexa Fluor 488相連, 再通過凝膠成像以及考馬斯亮藍染色檢測連接反應。蛋白SDS-PAGE結果顯示, 體系中有較多游離的Alexa Fluor 488存在, 而且由于信號較強, 影響目標產物的檢測。這時, 我們將會引導學生討論可能的原因是什么, 是反應效率較低, 還是熒光分子加入過量, 以及與之對應的解決辦法。感興趣的學生還可以在接下來的實驗中進行探索, 嘗試是否能真正解決問題。如若不能的話, 可能的原因又是什么等等。
同時, 我們在教材現有實驗設計的基礎上, 根據情況適時地調整相關試劑藥品的使用, 優化實驗操作。如在“以DNA模板控制的點擊化學”實驗中, 利用Gel Red替代溴化乙錠的使用。Gel Red是一種高靈敏、低毒性, 并且穩定的熒光核酸凝膠染色試劑。其特殊化學結構難以穿透細胞膜進入細胞, 從而降低了染料的細胞毒性。同時, 經過相關環境安全測試, 其廢棄物也可按照常規試劑處理。在合成DNA后的純化步驟中, 耗時、低回收率的乙醇-乙酸鈉-糖原純化產物體系以Amicon過濾管代替, 取得了良好的實驗效果。在“非天然氨基酸的定點嵌入與標記”實驗中, 以離心式脫鹽柱多次離心的方法取代過夜透析蛋白, 保留蛋白活性的同時更有效地利用了時間。傳統的考馬斯亮藍染色、乙酸乙醇脫色的方法被快速蛋白液染色、去離子水脫色替代, 從而盡量減少與刺激性氣體的接觸。六氟異丙醇 (HFIP) 溶解多肽的操作也必須在通風櫥內進行, 以減少對呼吸道以及皮膚的刺激作用。
2 化學生物學實驗教學的思考
在實驗課上, 我們會首先提醒本次實驗要注意的安全問題, 比如試劑的選擇, 藥品的不同處理方式等, 確定學生清楚了之后再開始實驗操作。實驗要點也會提前給予說明。但是在實驗過程中, 我們發現不同組學生在實驗過程中碰到的問題不盡相同, 學生處理問題的方式也不同。有的學生會注意課上所列出的實驗要點, 實驗過程中不清楚的地方主動詢問老師, 這樣的學生一般都能順利完成實驗, 達到實驗課程的目的。有的學生, 他們會對在實驗過程中觀察到的現象產生好奇心, 對同一個實驗步驟采用不同的操作, 希望能夠在實驗中尋找答案。此時, 只要是在安全性得到保障的情況下, 我們會盡可能地給學生留出嘗試的空間, 在實驗中解決他們感興趣的問題�！靶》肿右种频鞍踪|聚集”實驗涵蓋了蛋白質構象與某些人類疾病的關系[5]。實驗中, 首先將胰島淀粉樣肽 (Amylin) 固體溶解在六氟異丙醇 (HFIP) 中, 真空干燥完成后, 再通過DMSO溶解得到Amylin DMSO溶液。而作為抑制劑的酚紅試劑是利用去離子水d H2O溶解配成儲液。酚紅在d H2O中溶解度不高, 使用前超聲可以幫助溶解, 但仍有一部分不能完全溶解。對于一個定性實驗來說, 這其實并不會影響下游的操作及實驗結果。但在實驗過程中, 有的學生發現酚紅在DMSO中溶解度很好, 那么如果用DMSO取代d H2O溶解酚紅, 是否會對后續研究Amylin的聚集有影響?在安全操作DMSO的情況下, 這種探索性的問題可以通過配制不同比例的d H2O和DMSO的混合溶劑來回答。因此, 并不急于干涉學生的想法, 鼓勵并支持他們在安全條件允許下探索實驗課程相關內容也是化學生物學實驗課的課程特色。
隨著化學及生命科學領域的快速發展, 如何將研究熱點繼續融入到化學生物學實驗教學體系當中, 將研究成果轉化為實驗教學內容也給我們提出了新的挑戰。一方面我們積極地探討在已有實驗設計的基礎上, 將相關方向的新發展融入到實驗中, 讓學生不僅僅是完成一個實驗, 更重要的是通過這個實驗, 了解相關方向代表性工作的進展。另一方面, 要考慮新設計的實驗是否適應于本科教學, 實驗試劑藥品的安全性是否滿足, 實驗室現有的儀器設備是否可以支持項目的開展等方面。如開展RNA相關的實驗就要求實驗室及周邊環境潔凈度較高, 學生實驗操作比較嫻熟等�；瘜W生物學實驗都屬于綜合類實驗, 實驗內容覆蓋面較寬, 如何讓學生在有限的實驗課上達到實驗教學的目的, 實驗的可操作性也非常重要。在設計課程中, 我們會注重把相關的內容放到整個框架中去, 選擇哪些是在實驗準備期完成, 哪些又是需要學生獨立完成, 而且特別歡迎感興趣的學生參與到實驗準備過程中。
3 實驗相關設備安全操作
在開展實驗教學等工作中, 需要大量培養細菌、進行蛋白表達和純化、凝膠成像、DNA合成與表征等方面的工作。實驗中所涉及到的儀器設備, 諸如屬于特種設備的高壓蒸汽滅菌器、離心機、細胞破碎儀等的安全使用也是實驗室安全建設的重要組成部分。因此, 需要嚴格劃分實驗區域, 對運行溫度、實驗環境有要求的精密儀器, 要做到布局合理, 保持相對的潔凈環境, 及時通風換氣, 清潔桌面、地面等。
作為濕熱滅菌方法之一的高壓蒸汽滅菌, 是利用飽和壓力蒸汽對物品進行迅速而可靠的消毒滅菌。根據《特種設備安全監察條例》, 高壓蒸汽滅菌器使用前須首先辦理特種設備注冊登記, 并按照要求進行年度檢查和定期檢驗。年度檢查每年一次, 定期檢驗則須由檢驗機構進行, 一般為6年一次。在使用高壓蒸汽滅菌器時, 確保正確滅菌的最高溫度和時間通常為121°C, 15-20分鐘。使用時, 要注意往滅菌鍋內補充水、排水罐中的水位要保持在水線之下。滅菌器腔內裝載要松散, 以便蒸汽作用均勻。在高壓滅菌液體時, 如果使用有蓋容器應旋松蓋子, 防止產生爆裂。滅菌完成后須待溫度下降到80°C后再開蓋, 防止燙傷。
離心機的工作原理是利用高速旋轉產生的離心力, 把樣品中不同沉降系數和浮力密度的物質分離開。立式高速離心機在轉子加速過程中是利用自動識別轉子和動態慣量檢查來確認設備的使用安全。操作者在使用前, 應檢查所有蓋子、轉頭密封圈等是否有磨損, 如冷凍型離心機, 氣密性的受損有可能導致腔體內產生冷凝水和結冰。同時, 還要特別注意離心管的對稱平衡, 否則會導致轉子失衡, 很容易產生危險。臺式離心機操作時不要忘記蓋轉頭蓋。
超聲波細胞破碎儀的工作原理是利用超聲波在液體中的空化作用, 將電能量通過變幅桿在液體中產生高強度剪切力, 將細胞擊碎。使用過程中, 超聲波發生器產生出高頻高壓電能, 因此破碎一般在冰浴下進行, 從而防止大量產熱導致的樣品降解。利用超聲波細胞破碎儀處理不同體積、不同蛋白表達的樣品時, 需要選擇相應的探頭、功率和工作時間。
凝膠成像系統是通過紫外或白光光源對樣品進行光激發, 由CCD相機和大光圈鏡頭對樣品所發射的光通過特定波長濾光片后進行捕捉, 從而進行成像。主要用于蛋白、核酸凝膠成像及分析、免疫印跡分析等。成像儀進行開門操作時, 要注意佩戴護目鏡, 防止被紫外光輻射眼睛并造成對皮膚的傷害。
除此之外, 實驗過程中做好個人的安全防護也非常重要, 因為即使是很常見的混勻后的開蓋動作, 如果EP管中的液體過多, 也有可能靠著管蓋的彈性飛濺出來;進行凝膠電泳操作時, 一個將凝膠中梳子取出的動作, 都有可能將電泳槽中的緩沖液濺到臉上。所以操作不要過于劇烈、佩戴護目鏡等都是很重要的保護方式。尤其是對那些戴隱形眼鏡的學生, 如果腐蝕性的液體濺入眼中, 傷害更大。在超凈臺帶著丁腈手套使用酒精噴壺時, 噴壺一定要遠離酒精燈, 防止酒精沾到手套引發燃燒。大容量全溫搖床在使用前須開紫外燈滅菌以盡量減少噬菌體的污染。使用液氮凍存細胞、蛋白時, 要戴好棉手套防止被液氮凍傷。接觸過細菌的槍頭、固體含菌培養基需要先通過84消毒液滅活消毒后再丟棄。實驗中也會盡量采用一些無毒或微毒試劑替代有毒有害的試劑, 以減少污染來源[9]。
實驗安全是保障教學、科研順利進行的重要工作, 它不僅需要加大對實驗室安全及其他軟硬件建設的投入, 同時更需要我們大家積極樹立實驗主體的安全意識, 相互監督、相互提醒, 共同努力完成。
參考文獻
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[6]韓方珍, 曹詠, 馮蜀茗, 肖媚燕, 徐東風.實驗室研究與探索, 2012, 198 (8) , 463.
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